Polyploid Induction and Identification of Apple Rootstocks with Tolerance to Continuous Cropping

Su Xiafei ¹　Chai Shanshan ²　Mao Yunfei ¹　Zhang Lulu ¹　Yin Yijun ¹　Liu Yeping ¹　Pang Huiling ¹　Hu Yanli ^1*

1 College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University, State Key Laboratory of Crop Biology, Shandong Collaborative Innovation Center for Fruit and Vegetable Production with High Quality and Efficiency, Taian, 271018; 2 Shijiazhuang Polytechnic College, Shijiazhuang, 050200

*Corresponding author,ylhu8612@sohu.com

Abstract　In order to explore the suitable polyploid induction technology system of apple continuous cropping rootstock, the tissue culture seedlings of 12-2, which was selected as the main test material, were induced by colchicine immersion and mixed culture, different media and different culture materials. The mutation rate and survival rate of different combinations were compared and analyzed by flow cytometry. The method was used for identification. The results showed that: In the process of colchicine soaking treatment of stem segments, the highest survival rate was 74.3% when the concentration of colchicine was 30 mg/L for 24 h, but no mutant material was obtained, one mutant material was obtained when the concentration of colchicine was 50 mg/L for 48 h, and the mutation rate was 2.9%; In the process of colchicine soaking treatment of stem segments, it was found that two polyploid materials were obtained when the concentration of colchicine was 50 mg/L, one was homozygous tetraploid, one was chimeric, and the induction rate was 1% The results showed that the highest number of adventitious buds and the highest regeneration rate of adventitious buds was 68.6% in 30 g/L sucrose treatment, which was also significantly higher than that in other carbon sources such as sorbitol and glucose treatment, and two mutants were obtained; The regeneration rate of adventitious buds in MS medium was 68.6% and two mutants were 2.9%, which was the best in different medium treatments; Mutant strains were obtained from IAA, NAA and IBA, one mutant strain was obtained from IAA and NAA treatment respectively, and two strains were obtained from IBA treatment; N1 was the most prominent among the four culture materials (12-2, 31, N1, N2), and two mutant strains were obtained. Finally, a total of 17 mutant materials were obtained, one of which was homozygous tetraploid, and the others were chimeric. This study provided theoretical support for the polyploid induction technology system of apple rootstocks with continuous cropping tolerance.

Keyword　Apple Rootstock; Polyploidy induction; Colchicine; Tissue culture

苹果(Malus domestica)是蔷薇科(Rosaceae)苹果属(Malus)落叶乔木果树，其果实具有耐储藏、营养价值高、风味佳和生态适应性强等特点，深受人们的喜爱，为世界四大水果之一,位居中国水果产量之首，面积、产量均占世界总量的50%以上，年产值达2000余亿元(胡学飞等, 2018)，在发展农业、农村经济、出口创汇，农民致富增收等方面均发挥着积极的作用(庞桂娟, 2018)。但随着苹果产业的快速发展，苹果的重茬障碍也成为一个世界性的难题。

根据研究表明，中国每年约有2~3.3×10⁴ hm ²的苹果园面临更新再植，极大地损耗了人力、物力以及财力，苹果抗重茬成为果园更新换代的主要阻碍原因之一(毛云飞等, 2017)。有研究认为，出现重茬障碍的原因主要有土壤结构和土壤生物群落的变化、土壤养分失衡、土壤积毒等(Yu et al., 2000; 陈小翠等, 2018)。在国内外报道中治理苹果重茬障碍问题主要通过栽培管理(王建斌等, 2014; 王金政等, 2017)、土壤改良(Wilson et al., 2004)、抗性砧木的选育(王志强等, 2016)等方式。

在中国将海棠(Malus spp.)作为苹果砧木的研究报道有很多(宗鹏鹏等, 2013)，如，八棱海棠、平顶海棠、西府海棠等都广泛作为苹果砧木进行应用，但大部分都致力于耐盐碱、抗病以及其他生理胁迫的研究(张志晓等, 2017)，对于耐重茬方面尚未见报道。多倍体材料往往具有更高抗性，通过多倍体诱导的方法对耐重茬砧木进行组织培养，将染色体加倍突变，使得种质资源更为丰富，同时也填补了耐重茬砧木育种的研究空白。多倍体诱导在蔬菜、花卉以及果树等各植物均取得了不错的成效。Sinski等(2014)在葡萄的研究中也得到了验证。因此，研究苹果耐重茬砧木优系多倍体诱导，为苹果耐重茬砧木的筛选及种质创建提供了理论支撑与技术支持。

1结果与分析

1.1秋水仙碱浸渍法诱导多倍体

茎段再生存活数及存活率随着秋水仙碱的浓度升高而降低，当秋水仙碱浓度为30 mg/L，处理时间为24 h时，虽存活数及存活率低于对照但存活率在三个处理浓度中最高为74.3%。浓度为50 mg/L,处理时间为48 h时，存活率高于同时间段的其他两个浓度处理，为54.3%，存活数达19个(表1)。

表 1 茎段, 茎尖在秋水仙碱浸渍法下的成活情况 Table 1 Survival of stem segment and shoot tip in colchicine impregnation

在对茎尖的处理中，后代存活率与秋水仙碱浓度增加及处理时间的延长成反比。其中，当秋水仙碱浓度在30 mg/L和50 mg/L处理时间为24 h的处理，后代存活率分别为62.9%和60%，处理间没有显著差异。处理时间为48 h时，后代存活率差异较为明显处理浓度30 mg/L>50 mg/L>70 mg/L为40%、34.3%和28.6%。但在秋水仙碱浓度为70 mg/L处理时间为72 h的处理中后代存活数为0，抑制茎尖再生，不利于植株生长。

对比可知，材料部位之间处理存在着明显的差异，茎段各个浓度与时间段处理的存活率均高于茎尖处理，因此，以下试验均选以生长状况一致的带腋芽茎段。

1.2秋水仙碱混培法诱导多倍体

利用秋水仙碱混培法处理茎断对多倍体诱导效果显著(表2)，其中浓度为30 mg/L的秋水仙碱诱导的不定芽数与再生率虽小于对照处理，但显著高于50 mg/L、70 mg/L的处理，不定芽数均值最高可达21株，再生率为60%。虽然不定芽数与再生率随着秋水仙碱的浓度升高而降低，但在50 mg/L、70 mg/L的处理中均获得变异株，诱变率分别为5.7%和2.9%。通过秋水仙碱浸渍法和混培法两种处理茎段方式的比较可知，浓度为50 mg/L的混培处理诱导效果较好，以下试验处理均为50 mg/L的混培法处理。

表 2 秋水仙碱混培法对茎段再生植株多倍体诱导的影响 Table 2 Effect of colchicine mixed culture on polyploid induction of stem regeneration plants 注: 同列小写字母间表示差异显著性(P≤0.05) Note: Significant difference between lower-case letters in the same column (P<0.05)

1.3不同配置培养基的混培法诱导多倍体

1.3.1不同碳源对多倍体诱导的影响

当碳源为蔗糖处理时，蔗糖浓度为30 g/L的处理中获得变异株2株，诱变率为5.7%且不定芽数与再生率均高于蔗糖浓度为20 g/L和40 g/L的处理，20 g/L的处理与30 g/L和40 g/L的处理存在显著差异，在三个浓度处理中效果最差。在碳源为山梨醇的处理中，当质量浓度为30 g/L时，产生的不定芽数与再生率在三个浓度中最高，不定芽数达17株，再生率为48.57%，并获得1株变异株，诱变率为2.9%。而葡萄糖处理中，三个浓度处理的差异并不明显(表3)。

表 3 不同碳源对茎段再生植株多倍体诱导的影响 Table 3 Effects of different carbon sources on polyploid induction of stem regeneration plants 注: 同列小写字母间表示差异显著性(P≤0.05) Note: Significant difference between lower-case letters in the same column (P<0.05)

在同一浓度不同碳源的比较中，蔗糖各个浓度处理的不定芽数与再生率均高于其余两种碳源。在质量浓度为30 g/L的处理中，蔗糖的处理效果最佳，产生的不定芽数最多达24株，再生率为68.57%，对茎段的再生起着促进作用。

1.3.2不同生长激素对多倍体诱导的影响

三种生长素处理对于茎段再生植株多倍体诱导效果差异并不显著(表4)。其中生长素为IBA处理的培养基产生的不定芽数在三种激素处理中最多，后代再生率达67.62%，并获得2株变异株，诱变率达5.7%。IAA和NBA处理分别各自获得变异株1株，诱变率均为2.9%。由此可知，生长素为IBA处理的培养基对茎段诱导效果最佳，对植株的再生起到促进作用。

表 4 不同生长素对茎段再生植株多倍体诱导的影响 Table4 Effects of different auxin on polyploid induction of stem regeneration plants 注: 同列小写字母间表示差异显著性(P≤0.05) Note: Significant difference between lower-case letters in the same column (P< 0.05)

1.3.3不同培养基对多倍体诱导的影响

三种不同培养基的处理中，产生的不定芽数和再生率差异极为显著(表5)。其中三种处理的不定芽数和再生率的大小依次为MS>WPM>B5。MS培养基对茎段的增殖起着促进作用不定芽再生率达68.6%，并获得1株变异株，诱变率为2.9%。而B5培养基产生的不定芽数在三种处理中最低，不利于本材料增殖培养。

表 5 不同培养基对茎段再生植株多倍体诱导的影响 Table 5 Effects of different media on polyploid induction of stem regeneration plants 注: 同列小写字母间表示差异显著性(P≤0.05) Note: Significant difference between lower-case letters in the same column (P<0.05)

1.4不同材料对多倍体诱导的影响

本研究比较了四种材料茎段进行秋水仙碱混培法诱导效果，发现茎段增殖数没有明显差异(表6)。其中，12-2和31的不定芽再生率趋于一致为65.7%，变异株均为1株，诱变率为2.9%。N2的不定芽再生率在四种材料中最高为72.38%，并获得1株变异株，诱变率为2.9%。N1的茎断增殖数与再生率虽不及N2，但诱变率达5.8%并获得2株变异株。综合来看诱导材料N1的诱导效果最好。

表 6 不同材料对多倍体诱导的影响 Table 6 Effects of different materials on polyploid induction of stem regeneration plants 注: 同列小写字母间表示差异显著性(P≤0.05) Note: Significant difference between lower-case letters in the same column (P<0.05)

1.5流式细胞仪的鉴定

通过流式细胞仪的鉴定，分别出现四种峰值(图1)。通过峰值所在位置可判断植株的倍性。

图 1 流式细胞仪峰值图 注: A: 二倍体; B: 四倍体; C: 嵌合体; D: 混倍体 Figure 1 Peak value of flow cytometry Note: A: Diploid; B: Tetraploid; C: Chimera; D: Octoploid

2讨论

在高等植物细胞内植物多倍体是染色体进化的一种较为显著的特征，在多倍体植物的细胞内一般存在3个或3个以上的染色体组(黄群策和孙敬三, 1997)。在首次提出高等植物多倍体概念的同时，前人也证实了人工诱导植物多倍体存在的可能性(遗恳, 贵州人民出版社, 1984, 12)。目前生产上应用的苹果砧木二倍体和三倍体居多，多倍体作为砧木可以提高植株抗逆性(马荣群等, 2020)，而抗重茬砧木多倍体的培育尚未见报道，因此耐重茬砧木的筛选存在积极意义。在多倍体的诱导过程中选择合适的方法和剂量是成功的前提。在人工诱导植物多倍体时，秋水仙碱是常用诱导药剂，在细胞有丝分裂期间对纺锤丝的形成起到抑制作用从而达到染色体数目加倍的目的(Dhooge et.al., 2011)。近年来，在苹果(Malus domestica)、萝卜(Raphanus sativus L.)和文心兰(Oncidium hybridum)等果树、蔬菜及花卉上(马荣群等, 2020; 吴照云, 2017; 崔广荣, 2010 )广泛使用秋水仙碱与组织培养技术相结合的诱导方法诱导多倍体的产生。但在研究过程中发现，不同的诱导材料、秋水仙碱的浓度、处理时间以及方法等因素均会影响多倍体诱导的成功率。

秋水仙碱浸渍法成功在火龙果(程志号, 2020)多倍体诱导得到应用，李晓艳等(2010)研究发现，用浓度为0.1%秋水仙碱溶液浸渍越橘‘达柔’试管苗茎段，24 h处理的诱变效果最好，存活率28.90%，变异率 22.6%。何建等(2008)研究发现，将长穗桑无菌试管苗茎尖在浓度为0.2%的秋水仙碱中浸泡茎段72 h诱导率最高为16.70%。本试验研究秋水仙碱浸渍法对茎尖和茎段存活率的影响中发现，随着秋水仙碱浓度增加和浸泡处理时间的延长，其存活率在逐渐降低，30 mg/L秋水仙碱处理茎尖、茎段24 h时，存活率均为最高分别为62.9%、74.3%。但50 mg/L秋水仙碱处理茎段48 h时获得1株变异株，变异率为2.9%。当秋水仙碱浓度为70 mg/L浸泡时间达到72 h时，致死率达到100，存活率为0，可能浓度过高时间过长造成植株无法正常生长发育。本研究的研究结果与前人的研究结果有所不同，至于茎尖和茎断存活的差异性，后期值得讨论。

魏卓等(2020)在黄心猕猴桃的研究中发现浓度为0.15%的秋水仙碱混培法处理180 h，诱导率最高为20.00%。邱芬等(2017) 100 mg/L秋水仙碱混培法处理无籽刺梨，变异率为7.8%。武江等(2018)认为秋水仙碱浓度在0.02%混培法处理愈伤组织15 h诱导率最高，为41.67%。本试验在研究秋水仙碱混培法处理茎段的结果表明，随着秋水仙碱的浓度升高不定芽再生率也随之降低。但50 mg/L的处理获得2株多倍体材料，其中1株为嵌合体材料，1株为纯合四倍体，诱变率为5.7%，与前人得出的试验结果相似。

在组织培养的过程中，碳源的种类(杨宇晨, 2013)、生长调节剂种类(于亚军, 2002)、培养基的类型以及培养材料的不同均不同程度的影响茎段的生成与分化。本试验在研究蔗糖、山梨醇和葡萄糖三种碳源对植株再生诱导的影响中发现，蔗糖浓度为30 g/L的处理，诱变率最高，获得2株嵌合体材料。相同浓度的山梨醇处理获得1株嵌合体，而葡萄糖处理中不定芽再生率较低，为获得变异材料，抑制茎段增殖生长，综合来看，蔗糖效果最为突出。

有研究表明，培养基作为组培苗生长和发育的基床，其在诱导阶段对组培苗的影响至关重要，因为其成分包括了植物组织生命过程中对各种营养元素的需求(林兵, 2018)。在朱宏(2014)的研究结果中发现，五种基本培养基(MS, B5, N6, Miller和White)比较中，MS培养基最适合无菌芽增殖。陈峰等(2013)研究N6、B5、WPM、MS、1/2MS培养基对臭椿茎段再生诱导影响中发现，培养结果存在着显著差异，其中N6的诱导效果最佳。本试验利用MS、WPM和B5三种培养基对茎段进行诱导过程发现，MS培养基的诱导率高于其他两种，最适合本材料的茎段再生培养，并获得1株变异材料。由此可知，培养基的选择可能与培养材料有关。

本试验生长素处理，添加IBA的培养基，不定芽再生率达67.62%，获得2株嵌合体材料，而NAA和2,4D处理稍逊于IBA，均获得1株嵌合体材料。但与王军辉等(2011)的研究结果不同，研究表明IAA对楸树不定芽诱导的效果最为理想。

龙雪雁(2019)在对毛酸浆的研究中发现‘铁把青’品种的诱导结果要优于‘大黄菇娘果’和‘粒粒甜小菇娘’品种。同样，本试验的不同材料中，N1、N2的茎段不定芽再生率要高于12-2和31的茎段不定芽再生率，其中N1的诱导率达5%。说明不同材料诱导效果不同，多倍体材料抗性有待进一步研究。

3材料与方法

3.1试验材料

供试材料于2012年春，在烟台莱州市大沙岭村20年重茬果园中采用原位抗性育种法，筛选出海棠杂交株系(郭小静, 2015)。本试验将12-2作为前期主要筛选材料，通过秋水仙碱、培养基和激素种类等方法分析各处理的植株后代增殖状况和诱导率。

3.2试验设计

3.2.1水仙碱浸渍法对组培苗茎段多倍体诱导

以12-2为材料，在无菌条件下将组培苗切成小于2 cm的茎段(茎段至少保留一个叶腋)，并置于组培室温度为25±2 ℃，浓度分别为30、50、70 mg/L的秋水仙碱+MS+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂+0.2 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA的培养基中培养24、48、72 h，对照组为未经处理的组培苗。将处理过后的组培材料用双蒸馏水冲洗3~5次，无菌纸吸干茎段上的水分后转接到分化培养基中继续培养，每瓶5株，30 d后调查统计各处理植株的成活率，成活的植株继续转接于分化培养基中进行继代培养进行大量繁殖，3个月后对植株进行倍性测定。

3.2.2以秋水仙碱混培法诱导组培苗茎段多倍体

以12-2为供试材料，在无菌条件下将组培苗切成小于2 cm的茎段(茎段至少保留一个叶腋)，在分化培养基中预培养5 d后，置于组培温度以及浓度和成分与浸渍法相同条件培养基中进行培养直至新的腋芽长出，后接入分化培养基中继续培养。每瓶5株，30 d后统计各处理植株的存活率，3个月后对植株进行倍性测定。

3.2.3不同配置培养基对组培苗茎段多倍体的诱导

以12-2为供试材料，用50mg/L秋水仙碱混培法，改变 秋水仙碱+MS+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂+0.2 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA中碳源(蔗糖, 山梨醇和葡萄糖)、生长素种类(IAA, IBA和NAA)以及培养基种类(MS, WPM和B5)任意一个变量，控制好其他变量。每瓶5株，30d后调查统计各处理植株的成活率，成活的植株继续转接到分化培养基中进行继代培养大量繁殖，3个月后对植株进行倍性测定。

处理组合如下：

秋水仙碱+MS+30 g/L (蔗糖, 山梨醇, 葡萄糖)+6.5 g/L琼脂+ 0.2 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA

秋水仙碱+MS+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂+0.2 mg/L 6-BA+0.3 mg/L (IAA, IBA, NAA)

秋水仙碱+(MS, WPM, B5)+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂+0.2 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA

3.2.4不同组培材料对多倍体诱导影响

将供试材料为12-2、31、N1、N2四种生长状况一致的茎段，用50 mg/L秋水仙碱混培法，接种于秋水仙碱+MS+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂+0.2 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA的培养基中，组培条件不变。每瓶接种5株，30 d后调查统计各组培材料的存活数及存活率，对成活的植株进行继代培养(至少2次)，3个月后对植株进行倍性统计。

3.3试验方法

3.3.1流式细胞仪鉴定再生植株倍性

利用FACSVia-流式细胞仪(寰熙医疗, 上海, 中国)，以已知二倍体材料为对照，将待测植株幼嫩叶片组织切取1 cm²放入培养皿中，加入200 μL的细胞裂解液并用刀片迅速将叶片切碎，加入800 μL的DNA染色液，将培养皿中的液体用30 μm的滤网过滤至样品管2/3处，将样品管插入分析仪中进行测定，样品倍性根据分析所得的DNA含量峰值图来判断。用已知的二倍体材料作为对照调整放大倍数，使二倍体的DNA峰值的荧光强度处于50附近，则认定所测样品为二倍体，荧光强度处于100附近的为四倍体，以此类推。荧光强度处于50~100之间的为嵌合体。由此，根据细胞DNA含量峰值图所处的荧光强度可以确定出细胞倍性。

3.3.2统计方法

存活率(%)=(存活株数/接种总株数)×100%

不定芽再生率(%)=(产生不定芽株数/接种总株数)×100%

诱变率(%)=(变异株数/接种总株数)×100%  

3.4数据分析

利用 Microsoft Excel 2007进行数据整理。采用IBM SPSS statistics 19数据分析软件对所测数据进行统计分析。

作者贡献

宿夏菲和柴姗姗是本研究的实验设计者和实验研究的执行人；宿夏菲、柴姗姗和毛云飞完成数据分析以及论文初稿的写作；张璐璐、尹伊君、刘业萍和庞会灵参与实验设计和试验结果分析；胡艳丽指导实验设计、数据分析、论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由国家自然科学基金项目(32072520)、山东省重点研发计划(2018GNC113019)、山东省良种产业化项目(2019LZGC007)、山东省自然基金(ZR2020MC132)和山东省水果创新团队项目(SDAIT-06-07)共同资助。

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